1970年、Howard TeminとDavid Baltimoreにより、HIV（ヒト免疫不全ウイルス）やHBV（B型肝炎ウイルス）などのレトロウイルスの逆転写反応において逆転写酵素は発見されました。現在、最も一般的に使用されている逆転写酵素は、AMV（トリ骨髄芽球症ウイルス）およびM-MuLV（モロニーネズミ科白血病ウイルス）です。

 

 

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逆転写酵素は逆転写ウイルスが複製を合成する際に使用され、またウイルスそのものにコードされています。In vitroでは、逆転写酵素の特性に依存しますが、概ね40～50℃で反応を開始します。逆転写酵素はプルーフリーディング活性がなく、ミスリーディングが多い酵素です。これはウイルス由来の酵素であるためで、DNA Polymeraseと大きく異なる部分です。

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ネイティブな逆転写酵素は、複数の機能をもちます。そのDNA Polymerase活性は一本鎖RNAと一本鎖DNAに及びます。さらに、いくつかの逆転写酵素のRNase H活性は、RNA：DNAハイブリッドのRNAを分解します。テンプレートのRNA分解することは、cDNA合成後のPCRステップで大きな意味を持ちます。

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PCRは、DNAしかテンプレートとして用いられません。しかし、RNAをDNAに逆転写することで、RNAのPCR解析が可能になります。逆転写（RT）とPCRを組み合わせて反応させる場合、2つの方法があります。1つのチューブ内で逆転写反応とPCRを行う場合、これは1ステップRT-PCRと呼ばれます。逆転写反応とPCRを別々のチューブで行う場合、これは2ステップRT-PCRと呼ばれます。通常、1μgのトータルRNAからPCRに十分なcDNAが得られます。

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RT-PCRにおいて、逆転写反応とPCRの間でバッファー置換などの精製ステップを不要とするため、逆転写反応用のバッファーはPCRステップに加えられても問題のないものになっています。

逆転写反応には3種類のプライマーが選べます。このプライマーの選択は、逆転写反応の次のアプリケーションに大きなインパクトがあります。そのため、実験条件や選択するプライマーの影響などについて十分考慮する必要があります。

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オリゴ（dT）プライマーは、完全長のmRNAを逆転写する場合に用います。cDNAライブラリーの構築やcDANラベリングアプリケーションにおける、逆転写反応に用います。アンカーオリゴ（dT）₁₈プライマーは、ポリ（A）テールの端の特異配列開始点付近から逆転写反応が始まるようにデザインされています。このアンカーにより、不要に長いポリ（A）領域を含まないcDNAが得られます。

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しかしながら、mRNAが長い場合やポリ（A）テールを持たない（原核生物など）場合、ランダムヘキサマープライマーを使用します。ランダムヘキサマープライマーは、その構造からRNA鎖の様々な位置にランダムに結合し、RNAのあらゆる個所からの逆転写を可能にします。

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ランダムヘキサマープライマーとオリゴ（dT）プライマーをミックスして使用することも可能です。

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第3の選択肢として、遺伝子特異的プライマーがあります。遺伝子特異的プライマーはターゲットの配列だけを集中して逆転写しますので、高感度な実験が期待できます。1ステップRT-PCRの場合、PCRでも逆転写反応と同じプライマーを用いることになりますので、遺伝子特異的プライマーを用います。

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図 1：各種プライマーを用いた逆転写反応の概要

Panel A：オリゴ（dT）nプライマー（ここでは n = 18）
Panel B：アンカーオリゴ（dT）n プライマー（ここでは n = 18） ポリ（A）テールの端から逆転写反応が開始されます。
Panel C：遺伝子特異的プライマー
Panel D：ランダムヘキサマープライマー
V = A、C、G
B = C、G、T
N = A、C、G、T

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ノート：ランダムヘキサマープライマーは最終濃度60 µMで最適な結果が得られます。

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一般的にcDNA合成に用いられるレトロウイルス由来の逆転写酵素は、分子生物学で用いられるDNA Polymeraseより高いエラー率を示します。この正確性の低さは、塩基置換やフレームシフトの原因となります（フレームシフトはPCRでさらに増幅されます）。正確性の高いPCR酵素は昔から存在しますが、正確性の高い逆転写酵素は供給されていませんでした。ロシュ・ダイアグノスティックスは、正確性の高い逆転写酵素Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kitを提供します。この酵素は完全長cDNAの合成においても有用です。

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突然変異率の高さはレトロウイルスの特徴です。これは、ウイルスにコードされた逆転写酵素によるゲノムの複製メカニズムに起因します。この逆転写酵素はウイルスのゲノムRNAを二本鎖DNA（dsDNA）に変換する際に使用され、多くのエラーを含んで複製します。この正確性の低さは3'-5'エキソヌクレアーゼの欠失により説明されます。このような逆転写酵素のエラー率の高さは、多くのアプリケーションにおいて適当ではありません。

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このTranscriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kitの主要な構成品はTranscriptor High Fidelity Reverse Transcriptaseであり、この酵素はリコンビナントの逆転写酵素とプルーフリーディング酵素のブレンドです。この酵素ブレンドにより、一般的な逆転写酵素の約7倍の正確性で逆転写することが可能になりました。

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RNase H 活性