RT-PCR

Q: RNAの保存方法について推奨することはありますか?温度やエタノール濃度の最適値は?


A:

短期間の保存の場合、RNAseフリーのTEバッファー(10 mM Tris, 1mM EDTA )やRNaseフリーの水( 0.1 mM EDTAを含んだ )に溶解して - 20℃で保存できるとされています。
Note:RNAの保存のためにRNaseフリーにするには、EDTA溶液の使用が良く知られています(但し、古いEDTA溶液を使用した場合、微生物が存在し、結果としてRNase汚染を引き起こします)。また - 80℃では、分解する事無くRNAを保存できるとされています。

長期保存の場合、RNAをエタノール沈澱した後、- 80℃で保存します。RNAは- 80℃で(水やバッファーで再溶解し、- 80℃で保存も可能)NH4OAc/エタノール沈澱溶液中が最も安定です。

また精製されたRNAの保存方法は、
・再溶解したRNAに、70%または100%の二倍量エタノールを加え、ペレット状のままRNAを保存します。
・酢酸ナトリウム(Sodium Acetate )を添加後、遠心によってRNAを回収します。

また保存したいRNA溶液を幾つかのチューブに小分けして保存する事を推奨します。これによって、凍結融解によるRNAの損傷や、RNase汚染の両方に有効です。

RNAの回収と溶解
遠心分離後のRNAは、37℃で簡単に乾燥させたり、バキュームオーブンで乾燥させる事ができます。
Note:RNAペレットを完全に乾燥させないように注意します。完全に乾燥させたRNAペレットは、再溶解が困難になります。RNAを使用する実験の場合、すべてのサンプルを氷上におきます。この理由は、RNAを室温に置いた場合、とても分解され易くなるためです。RNaseフリーのTEバッファー( 10 mM Tris, 1mM EDTA )またはRNaseフリーの水(0.1mM EDTAを含む)をRNAに加え、再溶解し、その後氷上で15分間置きます。やさしくタッピング、または慎重にボルテックスを行います。

以後のアプリケーションのためのRNAの沈澱
精製されたRNAは、場合によってはその後のアプリケーション用に沈澱と濃縮が必要となります。酢酸アンモニウム( NH4OAc)沈澱( 0.1量の5 M NH4OAc、2?2.5 量の100%エタノール、- 20℃、25分以上)で、RNAを回収できます。濃度が低いRNA溶液(ng/ml)からのRNAを回収する場合、グリコーゲンyeast RNA等を加えます。

Note:Protector RNaseインヒビターはRNAの分離や精製、その他の様々なアプリケーションでRNAを分解から守るために使用します。