制限酵素
Q: ライゲーション効率が低いです。その理由は何ですか？
A:
いくつかの理由が考えられます。
・ATPやDTTのようなライゲーションバッファー組成の分解。新しいバッファーでもう一度ライゲーションします。
・制限酵素がライゲーションミックス中で活性を持っています。制限酵素反応後、反応液を65℃に過熱し制限酵素を不活性化します。加熱による制限酵素の不活性化の可能性に応じて、ライゲーション前にフェノール/クロロホルムとエタノール沈殿行います。
・DNA調製やライゲーション反応、制限酵素反応にヌクレアーゼがコンタミネーションしていないか確認します。
・リガーゼ濃度を確認します。平滑末端断片のライゲーションには、より多く（0.1 - 0.5ユニット/μl）のリガーゼ活性が必要です。
・ベクター同士がライゲーションしていませんか？脱リン酸化により5'リン酸基を除去し、脱リン酸化されている事を確認していますか？
・ライゲーションに失敗する他の理由は、ベクターとインサートのモル比が十分でないかもしれません。詳細はRapid DNA Ligation Kitの製品説明書をご覧下さい。
・機能的なコンピテントセルを使用しているか確認します。形質転換のコントロール実験を行います。
・ATPやDTTのようなライゲーションバッファー組成の分解。新しいバッファーでもう一度ライゲーションします。
・制限酵素がライゲーションミックス中で活性を持っています。制限酵素反応後、反応液を65℃に過熱し制限酵素を不活性化します。加熱による制限酵素の不活性化の可能性に応じて、ライゲーション前にフェノール/クロロホルムとエタノール沈殿行います。
・DNA調製やライゲーション反応、制限酵素反応にヌクレアーゼがコンタミネーションしていないか確認します。
・リガーゼ濃度を確認します。平滑末端断片のライゲーションには、より多く（0.1 - 0.5ユニット/μl）のリガーゼ活性が必要です。
・ベクター同士がライゲーションしていませんか？脱リン酸化により5'リン酸基を除去し、脱リン酸化されている事を確認していますか？
・ライゲーションに失敗する他の理由は、ベクターとインサートのモル比が十分でないかもしれません。詳細はRapid DNA Ligation Kitの製品説明書をご覧下さい。
・機能的なコンピテントセルを使用しているか確認します。形質転換のコントロール実験を行います。
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